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心臟缺血再灌注損傷后一氧化氮合酶的變化
作者：唐省三,馬亞珍,劉紅云,朱曉琴,雷水生【關(guān)鍵詞】 再灌注損傷
Changes of nitric oxide synthesis in cardiac ischemia reperfusion injury
【Abstract】 AIM: To investigate the expression and function of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and inducible NOS (iNOS) during ischemiareperfusion injury (IRI) in rat hearts. METHODS: IRI was induced by clamping the left anterior descending (LAD) of coronary artery for 1h, followed by reperfusion. Nitric oxide synthase (NOS) activities of hearts was assayed at various time points and NOS protein levels as well as NOS mRNA expression were determined by Western blot and RTPCR methods respectively. RESULTS: eNOS activity, protein level and mRNA expression all increased after 26 h of IRI and decreased after 3 d of IRI and then gradually returned to basal level after 21 d. iNOS was expressed after 12 h of IRI and reached the peak level at day 3 after IRI and then decreased to basal level. CONCLUSION: The expression of iNOS is high while that of eNOS is low during cardiac ischemiareperfusion injury. Proper regulation of eNOS and iNOS expression may be therapeutically helpful in treating patients with cardiac ischemiareperfusion injury.
【Keywords】 reperfusion injury; nitric oxide synthase; heart
【摘要】 目的： 研究大鼠心臟缺血再灌注損傷(IRI)過(guò)程中一氧化氮合酶(NOS) 的變化規(guī)律及其作用. 方法： 制作SD大鼠心臟IRI動(dòng)物模型,用同位素法測(cè)定正常及IRI心組織的NOS活性；用Western印跡和逆轉(zhuǎn)錄PCR法分析eNOS和iNOS 在IRI過(guò)程中蛋白和基因表達(dá)的變化.結(jié)果： 心臟eNOS活性、蛋白和mRNA表達(dá)水平，在缺血再灌注2~6 h后均增高，3天后降低，21天后逐漸恢復(fù)到正常水平. 心臟iNOS活性、蛋白和mRNA表達(dá)水平，在缺血再灌注12 h后開始表達(dá)，3天達(dá)高峰，然后逐漸降至正常水平. 結(jié)論： 單純?nèi)毖⒉灰餘OS 活性的明顯變化,再灌注損傷使NOS的mRNA表達(dá)增加,酶的合成增多,活性增高.
【關(guān)鍵詞】 再灌注損傷；一氧化氮合酶；心臟
0引言
一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)在心肌缺血再灌注中起著極其重要的作用［1］.一氧化氮合酶(nitric oxide synthesis, NOS) 可分為原生型(cNOS) 和誘生型(iNOS) .cNOS 依存在的部位分為神經(jīng)型(nNOS) 和內(nèi)皮型(eNOS).心臟組織內(nèi)的NOS同功酶有兩種,即eNOS和iNOS. 參與炎性反應(yīng)及急性排斥反應(yīng)等病理過(guò)程［2］. 我們研究eNOS和iNOS在心臟IRI中的變化規(guī)律及其作用,為其防治提供理論基礎(chǔ).
1材料和方法
1.1材料
SD大鼠購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；iNOS Assay Kit 購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所；一抗羊抗大鼠iNOS或eNOS mAb 購(gòu)自武漢博士德公司； HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG二抗購(gòu)自Sigma 公司； Trizol裂解液、Oligo(dT) 、TaqDNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV RT)均為美國(guó)Gibco 公司產(chǎn)品；eNOS和iNOS 引物及內(nèi)參照由上海博亞生物技術(shù)公司合成. 冠狀動(dòng)脈阻斷再灌注模型制備［3］后在不同的再灌注時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,收集心臟標(biāo)本,液氮急凍, -70℃保存?zhèn)溆?
1.2方法
取雄性200～220 g SD大鼠120只,隨機(jī)分為缺血再灌注（IRI）組和假手術(shù)（對(duì)照,Control）組，每組60只，在再灌注不同時(shí)間點(diǎn)（0, 0.5, 1, 2, 6, 12 h和1, 3, 7, 14, 21, 30 d ）處死大鼠，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5只.
1.2.1NOS活性的測(cè)定IRI組大鼠取左室缺血區(qū)心肌0.2 g,對(duì)照組大鼠取左室相應(yīng)區(qū)心肌0.2 g,采用iNOS Assay Kit進(jìn)行測(cè)定. 心組織NOS活性的測(cè)定采用3［H］精氨酸同位素法［4］ , 心組織在4℃含有1 mmol/L leupeptin, 2 mmol/L aprotonin, 1 mmol/L phenylemthylsulfonyl fluoride, 1 mmol/L DTT, 1 ml/L Triton X100的30 mmol/L HEPES緩沖液中勻漿,反應(yīng)液為30 mmol/L HEPES緩沖液(pH 7.4),含1 mmol/L CaCl2, 100 mmol/L NADPH, 300 mmol/L tetrahydrobiopterin, 1 mmol/L dithiothreitol,以40 mmol/L L3H精氨酸(37 kBq/反應(yīng)液)為反應(yīng)底物,在37℃下反應(yīng)30 min,用200 μL 含100 mmol/L EGTA的終止液終止反應(yīng),反應(yīng)體系過(guò)5 cm的Dowex離子交換層析柱,加閃爍液后讀取放射性記數(shù). 蛋白定量用Bradford法,NOS活性用每克蛋白秒fmol（即fkat/g）表示.
1.2.2Western印記檢測(cè)iNOS和eNOS蛋白表達(dá)IRI組大鼠取左室缺血區(qū)心肌0.2 g,對(duì)照組大鼠取左室相應(yīng)區(qū)心肌0.2 g,以5∶1(V/m)比例置勻漿緩沖液（含50 mmol/L Tris pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 5 g/L α
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