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探討調節蛋白表達的影響
摘要： 目的 探討失血性休克大鼠TM、TM mRNA的變化機制及參附的干預作用的研究。 方法 SD大鼠分成：假休克組，休克組，林格液復蘇組，參附復蘇組。休克及復蘇2h 后，處死大鼠取出肝臟, Western blotting法測TM 變化，用RT－PCR法測TM mRNA的變化。結果 假休克組有 TM 、TM mRNA表達。休克組、林格液復蘇組TM 表達下降，TM mRNA表達上調，與假休克組比較有顯著統計學意義。參附復蘇組TM 表達上調，TM mRNA 表達顯著下調恢復，與假休克組比較無統計學意義，與休克組、林格液復蘇組比較有顯著統計學意義。結論 失血性休克TM 蛋白表達下降，TM mRNA表達上調，與休克損傷有關。林格液對蛋白C激活系統表達無明顯調節作用。參附通過對內皮細胞的保護作用，具有抗休克作用。關鍵詞： 失血性休克 凝血酶調節蛋白 參附注射液
創傷死亡的首要原因是失血性休克。2007年歐洲重癥監護醫學協會、歐洲休克協會等專家發表《控制大創傷后出血的治療指南》，指出大出血患者常由血管損傷及凝血功能異常所致。血管內皮細胞的主要功能為抗血栓形成,這也是維持血液流動性的重要機制之一。PC系統發揮抗凝作用與血管內皮細胞上的凝血酶調節蛋白(thrombomodulin, TM) 、內皮細胞蛋白C 受體(endothelial protein C receptor, EPCR) 及血漿中的蛋白C(protein C,PC) 等有關。該系統是凝血酶生成后對凝血系統活化有負反饋作用的一個調節系統，不僅具有抗凝作用，而且在抗炎過程中發揮作用，當前重組人活化蛋白C對膿毒癥休克的治療已經取得了突破性的進展［１］。闡明PC系統在失血性休克的紊亂機制，對失血性休克的治療及預后具有重要意義。作者2008年1至5月通過研究建立失血性休克大鼠模型，用Western blotting法檢測肝臟內皮細胞TM 的表達水平，用RT-PCR法測TM mRNA的表達水平，觀察失血性休克抗凝系統變化機制及參附的干預作用。
1 材料與方法
1.1 一般資料 選用溫州醫學院動物中心提供的Sprague Dawley(SD)大鼠40只，體重250～300ｇ。隨機分為4組：假休克組(A組)，失血性休克組(B組)，林格液復蘇組(C組)，參附復蘇組(D組)，每組10只。按Lamson［２］的方法，改良后復制失血性休克動物模型。除A組外，其余大鼠均放血至40mmHg維持60 min，B組不復蘇，C組用3倍失血量的林格液復蘇；D組用含參附注射液 (10ml/kg)和林格液組成的3 倍失血量的液體復蘇。休克及復蘇2h 后，處死大鼠，立即取出其肝臟。
1.2 方法 （1）Western blotting法檢測大鼠肝臟組織勻漿TM 含量：制備蛋白質樣品，經SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE），轉膜，加TM小鼠單克隆IgG 抗體（Santa Cruz公司提供）與抗原結合，加辣根過氧化物酶標記的TM山羊抗小鼠IgG（碧云天生物技術研究所提供）與一抗的結合，用聯苯胺顯色，Image master VDS成像系統攝影存盤后應用計算機圖像分析軟件(Quantity one 4.4.0)行灰度掃描分析。以目的基因與β-actin的條帶灰度之比作為反映相對指標。(2)RT－PCR法檢測大鼠肝臟組織勻漿TM mRNA含量：取肝組織約100mg, 以Trizol試劑盒一步法提取細胞總RNA , 采用半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT -PCR ) 技術對轉錄產物進行擴增, 擴增產物經質量分數為2% 的瓊脂糖凝膠電泳后照相。電泳結果采用計算機圖像分析系統(Gel-pro) 進行掃描, 以灰度值表示電泳帶的強度。PCR所用引物采用Primer5.0計算機軟件設計，用BLAST驗證。由上海生工生物工程技術服務有限公司合成提供。
1.3 統計學處理 數據以均值±標準差（x±s)表示，采用SPSS 12.0統計軟件包處理，多組間相同指標的比較采用單因素方差分析，如差異有統計學意義則進一步行組內兩兩間比較，方差齊時采用LSD檢驗采用Student Newman Keuls法，方差不齊者采用Tamhane′s法。P＜0.05為差異有統計學意義，P＜0.01為差異有顯著統計學意義。
2 結果
A組大鼠肝組織有TM 、TM mRNA 表達。B組肝組織TM 表達下降， TM mRNA表達上調，與A組比較有顯著統計學意義（P
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